基于植物秸秆废弃纤维素的生物能源

纤维素是自然界中最丰富的可再生资源。全球每年通过光合作用固定二氧化碳产生干物质总量超过1千亿吨，其中几乎一半由纤维素组成。纤维素是由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接的大分子物质。纤维素分子通过分子内和分子间氢键和范德华力紧密连接成微纤维，然后进一步形成纤维素大分子。纤维素分子平行排列，相邻葡聚糖链的还原端位于微纤维的同一末段。纤维素分子形成高度有序的结晶区和无序的无定形区。纤维素在自然界中常常和其他物质结合在一起。纤维素分子深深嵌入于由半纤维素，果胶，蛋白质，木质素等组成的多聚混合大分子中。 半纤维素占据纤维素分子外层和分子间的空隙，植物纤维素被微生物降解之前，半纤维素必须先被降解（至少部分被降解）。阿拉伯呋喃糖基团可被阿魏酸和P-香豆酸等芳香酸脂化并参与木质素和半纤维素的交联，使纤维素的微生物降解显得极为复杂。

自然界存在着许多种真菌、放线菌和细菌能降解纤维素。嗜热厌氧纤维素降解细菌在高温厌氧下具有较强的纤维素降解能力，不仅可分解滤纸纤维，而且可利用未经处理的玉米秸秆和甘蔗渣等农用废弃纤维素，产生乙醇，乙酸，氢气，和二氧化碳等代谢产物。 

 嗜热厌氧细菌降解纤维素产生乙醇的研究

我们根据纤维素降解细菌和纤维素之间的粘附作用而设计的纤维素降解细菌分离和纯化的新方法，从新鲜牛粪，高温堆肥和本实验室保存的纤维素降解富集物中分离得到4株嗜热厌氧纤维素降解细菌，对获得的分离菌株进行了分类和鉴定，并研究了分离菌株直接转化纤维素产生乙醇的生物学特性。

一种新的纤维素降解细菌的分离纯化方法

少量样品加入到10mL纤维素滤纸液体培养基中，培养至滤纸变黄并开始降解。然后将0.5mL培养液转接到新鲜培养基中培养，重复5次。当第5次转接的培养基滤纸变黄后，吸除上清液，将滤纸用10mL新鲜培养基清洗两次并使之悬浮于培养基中。将培养基激烈振荡后，吸取0.5mL菌液转接至Whatman CFII纤维素粉液体培养基中，培养至纤维素降解细菌和纤维素粉发生粘附作用。用500r/min离心10min收集纤维素粉或让其自由沉入试管底部，吸除上清液，然后加入5mL已熔化的纤维素粉琼脂培养基，将试管缓慢而轻微地摇动使纤维素粉自由悬浮，10倍系列稀释并滚管培养至出现透明圈。在光镜下挑选出不含杂菌菌落的透明圈，将其转接至滤纸液体培养基中；培养至纤维素滤纸降解，吸取0.5mL培养液用纤维二糖琼脂培养基系列稀释并滚管培养至菌落成熟。将单菌落挑取至纤维素滤纸培养基中培养至纤维素降解。这一纯化步骤重复数次，以确保获得纯培养物。

纤维素降解菌株的分类和鉴定   

分离菌株为革兰氏染色阴性，直的或稍弯曲杆菌，菌体大小为0.4μm -0.6μm×3μm -15μm，严格厌氧，不还原硫酸盐，形成芽孢。多数芽孢着生于菌体顶端。分离菌株能利用纤维素滤纸、纤维素粉Whatman CFII、微晶纤维素、纤维素粉MN300和未经处理的玉米秆芯、甘蔗渣、水稻秸秆。分离菌株在pH6.2-8.9、温度45℃-65℃范围内利用纤维素，最适pH为7.0-7.5，最适温度为55℃-60℃，发酵纤维素产生乙醇、乙酸、H2和CO2。分离菌株还可利用纤维二糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇作为碳源。部分长度的16S rDNA序列分析表明，分离菌株EVA1与Clostridium thermocellum具有99.8％相似性。

分离菌株纤维素降解和产生乙醇的研究   

分离菌株在pH6.2-8.9，温度45℃-65℃的范围内能直接转化纤维素滤纸产生乙醇，最适pH为7.5-8.0，最适温度为55-60℃。分离菌株能利用纤维素滤纸，纤维素粉Whatman CFII，微晶纤维素，纤维素粉MN300和未经处理的玉米秆芯，甘蔗渣，水稻秸秆产生乙醇。乙醇浓度 ，纤维素降解率和培养基还原糖浓度均随培养时间延长而增大。不同的纤维素材料、pH值、温度、底物浓度、酵母粉含量、振荡、培养气相、外加O2或乙醇和外加葡萄糖或纤维二糖等因子均能影响分离菌株转化纤维素为乙醇的能力。最适条件下分离菌株利用1%纤维素滤纸培养120h产乙醇浓度为1123mg/L，纤维素降解率为59%。

嗜热厌氧纤维素降解菌对纤维素的粘附及其酶活性研究

嗜热厌氧纤维素降解细菌Clostridium sp.在降解纤维素的过程中，菌体对不溶性纤维素底物具有强烈的粘附作用。在透明圈中参与纤维素降解的菌体周围具有波纹状突起结构，并且菌体与纤维素的粘附位点是一个电子致密区域。该菌株产生的纤维素酶是与细胞相连的胞外酶，培养液中无纤维素酶活性。利用脱脂棉花为碳源培养产生的纤维素酶活性最大。该菌株纤维素酶在70℃下具有最大的酶活性。

  • 热纤梭菌Clostridium thermocellum 在降解纤维素初始阶段和不溶性纤维素片断紧密粘附。

  • 在含纤维素的固体培养基中，C. thermocellum 菌株降解纤维素后形成透明圈。

  • 热纤梭菌菌株的细胞产生末端芽孢，周生鞭毛。

  • 菌体表面着生波纹状突出的纤维素体 Cellulosome。

  • 在纤维素降解过程中，菌体通过纤维素体和纤维素紧密吸附。

参考文献

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    Ruyang Han, Jianfeng Mei, Hang Min, Meici Chen. 2001. Adherence of thermophilic cellulolytic anaerobe to cellulose and cellulase activity.  Journal of Zheijiang University (Agric.& Life Sci.), 27 (2):165-168.

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