厌氧微生物培养基配制

1.无氧水的配制

  1. 煮沸除氧：将100mL水在烧杯中加热煮沸约15分钟，利用持续加热沸腾除去部分氧气，

  2. 将煮沸后的50mL水趁热倒入至预置换氮气后的120mL厌氧瓶中，盖紧橡胶塞，

  3. 换气除氧：抽真空，换氮气，反复3次；如果没有真空装置，可趁热通氮气15分钟，盖紧橡胶塞，加铝盖；或灭菌后趁热再通氮气15分钟；这一步骤是为了进一步除氧，利用氮气置换出残留的氧气；

  4. 灭菌备用：将配制好的无氧水进行常规湿热灭菌20分钟。

2. 无氧溶液的配制原则

  • 假如该化学品耐高温，可先将化学品称于厌氧瓶中，然后按无氧水的配制方法配制无氧溶液。

  • 假如该化学品不耐高温（或耐高温），可将该化学品称量后转移入厌氧手套箱中，放置过夜，将该化学品溶解于事先配制好的无氧水中，再过滤除菌。

3.厌氧微生物生长所需的维生素和微量元素

以上介绍的无氧水和无氧溶液配制方法适用于维生素和微量元素溶液的配制。以安全和不破坏化学物质为原则，根据化学性质选择最佳配制方法。Widdel 和 Bak论文提供了厌氧微生物所需的维生素和微量元素（简称Widdel溶液）的配方。下列图片为该文献的扫描件，请引用该文献。

  • Nonchelated trace element mixture contains: HCl 100 mM, FeSO4 7.5 mM, H3BO3 0.5 mM, MnCl2 0.5 mM, CoCl2 0.8 mM, NiCl2 0.1 mM, CuCl2 0.01 mM, ZnSO4 0.5 mM, Na2MoO4 0.15 mM.

  • Selenite-Tungstate solution contains: NaOH 10 mM, Na2SeO3 0.02 mM, Na2WO4 0.02 mM.

  • Vitamin mixture contains: Sodium phosphate buffer (pH 7.1, 10 mM) 100 mL, 4-Aminobenzoic acid 4 mg, D(+)-Biotin 1 mg, Nicotinic acid 10 mg, Calcium D(+)-pantothenate 5 mg, Pyridoxine dihydrochloride 15 mg.

  • Thiamine solution contains: sodium phosphate buffer(pH 3.4, 25 mM) 100 mL, thiamine chloride 10 mg.

  • Vitamin B12 solution contains: H2O 100 mL, cyanocobalamine 5 mg.

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4. 厌氧微生物培养基的配制

  1. 先配制厌氧基础培养基，含有0.58 mM K2HPO4, 0.42 mM KH2PO4, 0.1 mM NH4Cl；

  2. 将上述混合液灭菌并冷却至室温；

  3. 分别配制单独的厌氧母液NaHCO3和CaCl2，灭菌并冷却至室温；加入到厌氧基础培养基中，至终浓度10 mM NaHCO3, 0.25 mM CaCl2；

  4. 下列5种Widdle溶液按终体积百分比加入厌氧基础培养基中：0.1%(v/v) Nonchelated trace element mixture, 0.05%(v/v) Selenite-Tunstate solution, 0.1%(v/v) Vitamin mixture, 0.1%(v/v) Thiamine solution, 0.1%(v/v) Vitamin B12 solution；

  5. 配制所研究的厌氧菌所需的碳源、电子供体、电子受体、还原剂、和酵母粉等的厌氧母液。

  6. 分别加入不同的电子供体、电子受体、碳源等配制成适用于不同生理条件的厌氧微生物生长：以乳酸、硝酸盐、硫酸盐为例

  • 硝酸盐还原菌培养基：20 mM Sodium lactate为碳源和电子供体, 20 mM NaNO3为电子受体；

  • 发酵性细菌培养基：20 mM Sodium lactate为碳源，2.5mM Cysteine hydrochloride为还原剂，0.5g/L Yeast Extract；

  • 硫酸盐还原菌培养基：20 mM Sodium lactate为碳源，20 mM Na2SO4为电子受体, 2.5mM Cysteine hydrochloride为还原剂，0.5g/L Yeast Extract

注意要点 

  • 以上实验均应该在严格厌氧操作条件下完成 。

  • 基础培养基、碳源、电子受体供体等均可根据不同的环境条件和生理菌群加以改变。

  • 上述基础培养基配方组分仅供参考，可能不适用于你所研究的特定微生物种。

参考文献 

Widdel F, Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. In: Balows A, Trüper H G, Dworkin M, Harder W, Schleifer K-H, editors; Balows A, Trüper H G, Dworkin M, Harder W, Schleifer K-H, editors. The prokaryotes. IV. New York, N.Y: Springer-Verlag; 1992. pp. 3352–3378. 

韩如旸. 厌氧微生物培养基配制. 2020. 网站：ruyangmicrobio.org/anaerobic-media