腐乳三章
3. 腐乳的宏微之道：软糯咸鲜香臭合一的微生物机理
腐乳作为一种传统发酵食品，其中参与发酵过程的微生物对腐乳风味和品质的转化起着决定性作用，腐乳的产生和发展必定和古代先民们对微生物对食品发酵的作用的理解密不可分。不同类型腐乳中的优势菌群组成存在显著差异，这些微生物通过其特有的代谢活动和酶系作用，影响着腐乳的风味形成、营养转化和生物活性物质的产生。在现代微生物学应用于腐乳研究之前，我国人民就已经掌握了白腐乳、红腐乳、和青腐乳等不同种类腐乳的发酵技艺，本质上是利用不同微生物种群代谢活性的腐乳发酵调控技艺。第三章《腐乳的宏微之道：软糯咸鲜香臭合一的微生物机理》对于腐乳发酵的微生物学机理进行综述，包括：1.参与腐乳发酵的主要功能微生物：霉菌、细菌、和酵母，是关于腐乳发酵相关的纯种微生物的分离、纯化、及其生理学的总结；2.自然发酵型腐乳的微生物多样性，主要对利用高通量测序技术测定的不同腐乳样品中的重要微生物菌群进行分析和总结；3.腐乳风味形成的微生物和生化机理；4.应用于腐乳开发的创新技术。
3.1 腐乳发酵中的功能微生物
霉菌
在霉菌型腐乳中，毛霉属（Mucor）真菌是最主要的功能微生物。除了前文提及的由魏嵒寿先生于1929年分离并发表在《Science》杂志上的腐乳毛霉（Mucor sufu）之外，方心芳先生分离得到的五通桥毛霉（Mucor wutungkiao）之外，还有总状毛霉（Mucor racemosus）和梨形毛霉(Mucor piriformis) (1)等常见腐乳毛霉菌种。毛霉主要作用于腐乳前发酵阶段，高产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等生物酶；其发达的菌丝体使坯体紧紧包裹毛胚，有助于在盐渍期维持腐乳的外观形状(1)。
从地方特色腐乳中分离到了多株具有独特功能的毛霉，比如杨智慧从云南牟定腐乳前发酵毛坯中分离纯化获得了白色的优质总状毛霉，并应用于低盐腐乳的制备(2)。陈晨等从云南路南腐乳的毛坯样品中分离纯化得到优势菌株，分别属于白地霉和巢状毛霉，其最佳发酵条件为菌液浓度106 CFU/mL、接种量2％、发酵温度28.3℃、发酵时间3 d，此时蛋白酶活力达到215.5 U/g(3).
在红曲生产中，红色红曲菌( Monascus ruber ) 和紫色红曲菌(Monascus purpureus ) 常被应用于红腐乳后发酵阶段，其菌丝能分泌多种酶系，如蛋白酶、淀粉酶、麦芽糖酶等增进腐乳鲜味，并为红曲腐乳产生红色素(1)。
细菌
细菌型腐乳氨基酸生成率较高，味道鲜美、质地细腻、口感润滑。参与腐乳发酵的细菌除了之前提及的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) (1)之外，主要还有以下一些细菌在腐乳发酵和陈化过程中对腐乳风味和品质形成起到重要作用，详见姚粟等的《中国传统发酵食品用微生物菌种名单研究( 第二版)》中的总结(1)。
巨大普里斯特氏菌Priestia megaterium （原名为巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium）在腐乳后发酵阶段的功能为产蛋白酶，降解大豆蛋白生成短肽和氨基酸，降解腐乳发酵产生的生物胺，产生细菌素等抑制杂菌生长(1)。玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea)是自然发酵的克东腐乳中优势菌，产蛋白酶、肽酶和脂肪酶等生物酶，水解大豆蛋白产生氨基酸，提升产品风味和品质(1)。克氏罗斯氏菌(Rothia kristinae)参与细菌型克东腐乳的后发酵，通过蛋白水解和脂解活性促进腐乳风味的形成。该菌种具有亚硝酸盐和硝酸盐还原酶活性，可抑制脂质氧化、防止产品酸腐(1)。
腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)存在于白方腐乳后发酵阶段，能够显著提升白腐乳氨基酸态氮含量，加快产香速度(4)。肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)是细菌型克东腐乳的优势菌，产蛋白酶、脂酶、凝固酶、硝酸盐还原酶等，有助于提升腐乳的品质(1)。
乳酸菌主要功能为分解糖类产生乳酸、乙醋酸等有机酸；生成细菌素、过氧化氢、双乙酰等物质抑制杂菌生长；分泌蛋白酶、酯化合成酶等生物酶，促进乳酸乙酯、乳酸丁酯、醋酸丁酯生成；产生有机酸、醛类、酯类、氨基酸等多种风味物质(1)。干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis)、嗜盐四生球菌(Tetragenococcus halophilus)、嗜酸乳杆菌( Lactobacillus acidophilus )、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis) 、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、鼠李糖乳酪杆菌( Lacticaseibacillus rhamnosus)等是主要参与腐乳后发酵的乳酸菌种。植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ) 具有蛋白酶和酯酶水解能力，在腐乳后发酵阶段对腐乳的成熟和风味具有潜在作用(1)。弯曲广泛乳杆菌(Latilactobacillus curvatus)在腐乳后发酵阶段代谢产生乙醇和多种有机酸，进而形成酯类等特殊香气代谢物。混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)是参与腐乳发酵的重要乳酸菌之一，其对腐乳后发酵进程和风味有重要影响(1)。鲁绯等从青方中分离中3株乳酸菌，分别为短小奇异菌、片球菌、和植物乳杆菌(5)。刘芸等从农家自制传统发酵豆腐乳中分离得到一株发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum FJAT-46777。该菌对豆类植物为主的基质具有更优良的发酵特性，发酵时间快，乳酸菌含量高，产酸能力强，适用于发酵豆乳的开发(6)。
酵母
对于腐乳酵母的纯培养研究比较少。粉状米勒酵母(Millerozyma farinosa)具有较强的耐盐能力，在腐乳后发酵时期，降解腐乳发酵过程中产生的生物胺，对腐乳风味物质的形成有重要作用(1)。费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)存在于腐乳后发酵过程中，产蛋白酶、淀粉酶、麦芽糖酶等生物酶，还能产生烷基苯酚、4-乙基愈创木酚和乙醇等香气物质(1)。库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) 参与腐乳的整个发酵阶段，在高温条件下能高产乙醇，抑制杂菌，增加腐乳风味(1)。
3.2 自然发酵型腐乳的微生物多样性
随着高通量测序技术的发展和应用，腐乳发酵的微生物学研究进入微生物组学阶段。对不同地区腐乳的高通量序列分析显示，不同来源的腐乳中的微生物群落组成具有显著的地域特征。
白方、红发、和青方三大类腐乳的菌群组成各不相同，但白方腐乳和红方腐乳的菌群较为接近。红方腐乳中的主要微生物有乳球菌属(Lactococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，四联菌属(Tetragenococcus)；白方腐乳的主要微生物有不动杆菌属，乳球菌属，假单胞菌属(Pseudomonas)，四联菌属，乳杆菌属(Lactobacillus)，金黄杆菌属(Chryseobacterium)。青方腐乳的主要微生物类群为乳杆菌属、赤水菌属（Chishuiella）、四链球菌属。恩施地区的花色腐乳中的细菌主要为假单胞菌属、不动杆菌属、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、布丘氏菌(Buttiauxella)和草螺菌(Herbaspirillum)(7)。张雅婷等报道了腐乳中的主要真菌有霉菌，包括毛霉属(Mucor)，根霉属(Rhizopus)等，以及酵母菌，包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，假丝酵母属(Candida)，毕赤酵母属 (Pichia)等(8)。
赵恒等利用高通量序列分析研究了湖北省襄阳市谷城县茨河镇花色腐乳的微生物多样性与菌群功能。茨河花色腐乳的优势菌群为假单胞菌属(Pseudomonas)，乳杆菌属(Lactobacillus)，鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)等6个菌属，其中假单胞菌占比超过50%，乳酸菌共占比31.63%；真菌优势菌群为红酵母属(Rhodotorula)，毛霉属(Mucor)，青霉属(Penicillium)，间座壳属(Diaporthe)，赤霉属(Gibberella)等13个真菌属，共5个酵母类群与8个霉菌类群(7)。
兰林等对4种豆腐乳样品（纯种发酵和自然发酵）进行高通量测序和序列分析，其中主导菌群为13个优势细菌属（平均相对丰度＞1%），分别为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、魏斯氏菌属（Weissella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、明串珠菌属（Leuconostoc）、泰氏菌属（Tissierella）、依格纳季氏菌属（Ignatzschineria）、哈夫尼菌属（Hafnia）、沙雷氏菌属（Serratia）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、库特氏菌属（Kurthia）、马阔里类芽孢杆菌属（Paenisporosarcina）。不同豆腐乳样品间的细菌菌群结构有所差异，但共有优势细菌属为假单胞菌属、乳杆菌属、透明颤菌属、魏斯氏菌属、不动杆菌属和明串珠菌属。假单胞菌属是微生物的重要类群，易分解蛋白质，在蛋白质含量较高的肉类、大豆和奶类制品常受到假单胞菌的污染，是造成食品腐败的常见菌属，且在市售及家庭小作坊自然发酵的豆腐乳中的相对丰度较高，表明易受该细菌的污染造成腐乳的腐败和变质(9)。真菌主要有19个优势真菌属组成，分别为酵母属（Saccharomyces）、曲霉属（Aspergillus）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、短梗霉属（Aureobasidium）、镰刀菌属（Fusarium）、毛霉属（Mucor）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、青霉菌（Penicillifer）、有孢圆酵母属（Torulaspora）、丝孢毕赤氏酵母属（Hyphopichia）、被孢霉属（Mortierella）、枝孢属（Cladophialophora）、毛孢子菌属（Trichosporon）、双生子囊属（Dipodascus）、乳香菌属（Talaromyces）、东方伊萨酵母菌属（Issatchenkia）、柯达酵母菌属（Kodamaea）、球囊菌属（Plectosphaerella）。共有优势真菌属为曲霉属、曲霉属、德巴利氏酵母属、短梗霉属、假丝酵母属和有孢圆酵母属，以酵母菌为主(9)。
周小虎和李理研究了广东白豆腐发酵过程不同阶段的样品。在酸浆水和白坯中相对丰度较高的有乳杆菌属（Lactobacillus）、醋酸菌属（Acetobacter）；毛坯中的优势菌属是库特氏菌属（Kurthia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）；盐坯中的优势菌属是库特氏菌属（Kurthia）、魏斯氏菌属（Weissella）和不动杆菌属（Acinetobacter）；后酵45 d样品中的优势菌属是明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）和四联球菌属（Tetragenococcus）；后酵90 d样品中的优势菌属是库特氏菌属、明串珠菌属和乳球菌属；后酵180 d样品中的优势菌属是四联球菌属、库特氏菌属和魏斯氏菌属(10)。
付瑞敏等对全国各地16种不同的腐乳样品进行了高通量测序分析。结果表明，16种腐乳样品中的真菌群落主要由土赤壳属（Ilyonectria）、曲霉属（Aspergillus）、酵母属（Saccharomycopsis）、放射毛霉属（Actinomucor）、假丝酵母属（Candida）、根霉属（Rhizopus）等胞外水解酶产生菌组成。腐乳样品中的细菌群落由可水解蛋白的芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、梭菌属（Clostridium）、肠球菌属（Enterococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）等增味菌和不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）等潜在的致病性或腐败菌株组成(11)。除了上述优势菌群之外，样品中还检测出短梗霉（Aureobasidium）、聚孢霉（Clonostachys）和金黄杆菌属（Chrysobacterium）等腐乳中的一些稀有属，这些属均来自于大豆材料，其存在会影响腐乳发酵微生物群落的组成(11)。
石黎琳等利用高通量分析了腐乳发酵过程中的微生物菌群的动态变化(12)。豆腐表面开始生长菌丝为发酵第一阶段，占比较大的细菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、乳球菌属（Lactococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas），真菌属为久浩酵母属（Guehomyces）和假丝酵母属（Candida）；菌丝生长完全后为发酵第二阶段，占比较大的细菌属为类香味菌属（Myroides）、丛毛单胞菌属（Comamonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），真菌属为久浩酵母属（Guehomyces）和假丝酵母属（Candida）；成品豆腐为发酵第三阶段，占比较大的细菌属为乳球菌属（Lactococcus）、果胶杆菌属（Pectobacterium），真菌门为子囊菌门（Ascomycota），真菌属为链格孢属（Alternaria）、赤霉菌属（Gibberella）。整个发酵过程中微生物群落结构分布变化明显，不同阶段主要存在的菌属不同，既有利于发酵的有益菌属，也有影响食品安全的有害菌属(12)。
孙娜等对发酵前期青腐乳和发酵末期青腐乳卤水中的微生物多样性及风味成分进行分析。微生物菌群在发酵前期和末期差异显著，尤其是明串珠菌属（Leuconostoc）和盐厌氧菌属（Halanaerobium）。发酵末期与发酵前期卤水中分别含27 种和45 种挥发性成分，两者有6 种相同的成分，只有发酵末期青腐乳中检测出了提供臭味的含硫化合物及吲哚。菌属与风味物质相关性分析表明，Leuconostoc、Halanaerobium与含硫化合物、吲哚紧密相关，是臭味的主要来源；乳杆菌属（Lactobacillus）、四联球菌属（Tetragenococcus）和Chishuiella与酯类、酮类、醇类相关性最大，为青腐乳提供香气(13)。
3.3 腐乳纯培养微生物基因组分析
赵磊等对分离自臭豆腐的球形赖氨酸芽孢杆菌菌株C5.1 (Lysinibacillus sphaericus C5.1)进行全基因组测序、基因预测、及功能注释。序列分析发现，C5.1菌株基因组中包含从尿卟啉原III逐步转化合成VB12的关键酶。解析C5.1 菌株的基因组中关键酶的序列为研究在臭腐乳发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础(14)。
张栖等对雅致放射毛霉(Acitinomucor elegans)菌株CJ-6进行全基因组测序及基因功能注释。CJ-6菌株具有丰富的碳源、风味前体氨基酸及脂肪代谢途径，这对腐乳发酵过程中的风味形成具有重要意义。此外，从次级代谢产物分析结果可知，该菌株不具备产生真菌毒素等致病性物质的能力(15)。
微生物群落结构的地域特异性和发酵过程中的动态演替规律，揭示了不同类型腐乳特色风味形成的微生物学基础，为腐乳工业化生产中的菌种选育和工艺优化提供了科学依据，也为发酵过程的精准调控提供了新的思路。目前腐乳相关的基因组和其它组学研究还是比较初步，未来的研究应当进一步结合功能基因组学和代谢组学等方法，深入解析关键功能菌株的作用机制，为腐乳产业的创新发展提供理论支撑。
3.4 腐乳风味形成的微生物机理
3.4.1 腐乳的风味物质
腐乳的风味物质主要包括呈味物质和挥发性香气物质两大类。呈味物质主要由氨基酸、肽类、有机酸和核苷酸等构成，贡献了腐乳特有的咸鲜味。挥发性物质则包括醇类、醛类、酯类、含硫化合物等，共同构成了腐乳独特的发酵香气。
呈味物质
游离氨基酸是腐乳呈味物质中最重要的组分之一。谷氨酸是最主要的鲜味物质，含量可达0.8-1.2g/100g，与天门冬氨酸协同作用产生强烈的鲜味。此外，甘氨酸和丙氨酸贡献了一定的甜味，而亮氨酸和异亮氨酸则通过代谢产生特殊的发酵香气。小分子肽，特别是二肽和三肽，不仅具有独特的呈味作用，还具有增鲜效果。某些环状肽的存在则为腐乳增添了特殊的香气。在有机酸方面，乳酸作为主要有机酸不仅影响产品的pH值，还直接参与风味的形成。琥珀酸具有特殊的鲜味，而柠檬酸则能够增强整体风味。
挥发性香气
腐乳的挥发性香气物质构成了其独特的发酵香气，详述参见李慧等人的综述《腐乳挥发性成分的研究》(16)。
白腐乳
在白腐乳样品中测得的63种成分中，有19种醇、15种酯、7种吡嗪、7种酮、5种吡啶、4种醛、3种混杂成分、2种含硫成分和1种呋喃(16)。
腐乳中的醇大多具有独特风味，例如丙醇(酒精味、甜味)、丁醇(甜味、香脂味)、1-戊-3醇(奶油味、淡淡的新鲜味)、戊醇(甜味、香脂味)、己醇(水果味、芳香味)、辛醇(坚果味、草味、甜瓜味、柑桔味)、苯基乙醇(淡淡的风信子花味)、4-乙基酚(木质味、酚味、甜味)、2-甲基4-乙烯基苯酚(香辣味、丁香味)、4-乙烯基苯酚(香草味)(16)。
戊醛、苯甲醛、2-苯基2-丁醛会产生诱人的风味，己醛能够使豆乳和大豆组织蛋白产生新鲜味。大多数酯类具有独特的气味，如丁酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯都有水果味及其他诱人的风味(如菠萝味、蜂蜜味)；大分子量的酯也可以产生特有的风味(如十四酸乙酯、十六酸乙酯、十八酸乙酯)，它们分别具有香菖根味、微弱的辣味、淡淡的花味。白腐乳中有2-甲硫基乙醇和3-甲硫基丙醇，含硫成分通常具有强烈的甜汤味或肉味(16)。
混杂成分包括3-甲基-1H-吡咯、萘和1H-吲哚。3-甲基-1H-吡咯具有强烈的烟味、轻微的木质味和草本味。1H-吲哚在高浓度时具有不愉快的味道、尸臭味、粪便味和腐烂味，但在低浓度时具有花香味(16)。
红腐乳
除了上文中提及的白腐乳中成分以外，红腐乳的成分更复杂多样(16)。苯乙醛和2-苯基-2-丁烯醛存在于没有风味的大豆组织蛋白中，前者稀释后具有山楂味，后者具有黑茶叶味。4-甲氧基苯甲醛具有甜的含羞草味和山楂味，肉桂醛则具有辛辣的肉桂味。
红腐乳中还测得琥珀酸二乙酯、肉桂酸乙酯。前者具有微弱的香味，而后者具有甜味、蜂蜜味、香脂味、肉桂味及梅干味。红腐乳中的丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的平均浓度明显高于白腐乳。
芳樟醇具有花香味、柑桔味和甜香味；茴香脑具有大茴香味及甜味；丁香酚具有香辣味；香豆素具有甘草一样香辣的味道。1H-吡咯具有坚果味、甜味及醚味；2-甲基-1H-吡咯稀释后具有烟味、木质味、草本味；2-乙基吡咯具有面包味、胡桃味和甘草味。
含氧化合物中的5-甲基呋喃具有新鲜的焦糖味及香辣味；2-氢呋喃酮具有微弱的焦糖昧；3-羟基-2-甲基4吡喃酮具有麦芽烘烤味。
红腐乳中发现的特有醇类中3-甲基丁醇具有杂醇油味、威士忌酒味；3-苯基-2-丙稀醇具有甜味、香脂味、风信子味。2-乙基己醇具有淡淡的甜味及轻微的玫瑰味。
红腐乳中特有的含硫化合物包括3-甲硫基丙醛具有肉味、大豆酱油味；3-甲硫基丙酸乙酯具有菠萝味、柑桔味(16)。
青腐乳
孙娜等研究表明(13)，发酵前期青腐乳的挥发性物质成分以醇类和酸类为主，主要呈花香、果香、酒香和酸味。3-辛酮、2-戊基呋喃的含量也较高，3-辛酮具有水果的香气，2-戊基呋喃具有豆香和果香的气味。发酵末期青腐乳卤水中的挥发性物质成分以含硫化合物、醇类和酯类为主，其中含硫化合物含量最高，主要为二甲基二硫化物、二甲基三硫化物和二甲基四硫化物，二甲基三硫化物和二甲基四硫化物相对含量高达20%，其次是吲哚。含硫化合物和吲哚的嗅觉阀值很低，在较低浓度时就能闻到臭味，浓度高时具有强烈的臭味，增强了青腐乳的特征香气(13)。
台湾腐乳
梅燕蓀研究分析了台式腐乳在不同发酵阶段的风味物质变化，共鉴定出90种挥发性成分，包括醇类（22种）、酯类（22种）、醛类（21种）、脂肪酸（10种）、酮类（9种）、其他成分（6种）。主要风味物质为醇类和酯类，其含量随发酵时间增加而提高(17)。
3.4.2 腐乳风味物质转化的生化途径
影响腐乳风味形成的因素众多。微生物菌群方面，优势菌种的类型、菌群的代谢特性以及微生物间的互作关系都直接影响着风味物质的产生。原料特性如大豆品质、蛋白质含量和脂肪酸组成也是重要因素。
腐乳风味物质主要是豆腐中的蛋白质、脂肪、和糖类由微生物酶介导的水解而形成。在蛋白质降解途径中，微生物蛋白酶系统首先将蛋白质水解生成氨基酸，随后通过转氨基作用产生α-酮酸，部分氨基酸经脱氨基作用生成有机酸，还有部分通过脱羧作用形成胺类物质。
脂肪约占腐乳干重的20-30%。发酵过程的微生物脂肪酶作用途径始于脂肪酶对甘油三酯的水解，产生的游离脂肪酸经过氧化和酯化反应生成各类酯类化合物，同时通过β-氧化产生短链脂肪酸；而后脂肪酸氧化产生醛类、酮类、醇类、羧酸类、呋喃类等风味物质(18)。解春芝等从不同腐乳共检测出15种不同的游离脂肪酸，主要为亚油酸（43-50%）、油酸（22-28%）、和棕榈酸（11-14%）等。游离脂肪酸组成比例排序为酱腐乳>克东腐乳>白腐乳>贵州土腐乳>青腐乳>糟方腐乳>红腐乳>白菜腐乳(18)。
在碳水化合物发酵途径中，糖酵解产生乳酸，通过柠檬酸循环产生各种有机酸，同时次级代谢产生醇类和醛类化合物。
在发酵过程中，工艺参数如温度、湿度、盐度、发酵时间等都会影响微生物代谢速率、酶活性、代谢产物的形成、风味物质的积累程度。后发酵条件和添加的辅料等则影响着风味的成熟程度和最后风味。
3.3.3 腐乳风味物质形成的微生物机理
腐乳发酵前期霉菌大量繁殖，蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、肽酶等各种酶系分泌活跃，蛋白酶和肽酶使大豆蛋白水解成短肽和游离氨基酸，为主要鲜味物质。前发酵中白坯到毛坯阶段，谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及赖氨酸含量增长迅速，其中苯丙氨酸和亮氨酸代谢形成2-苯乙醇和3-甲基丁醇。在腐乳前发酵阶段，脂肪酶降解豆腐坯中粗脂肪的能力加快，在腌坯阶段由于辅料的添加使酶活力下降，游离脂肪酸生成速度随之下降，在后发酵期由于酶活力的回升和后酵时间延长，游离脂肪酸总量逐步增加，醇类(乙醇、2-苯乙醇和3-甲基丁醇)的添加与脂肪酸(亚油酸、棕榈酸、油酸)通过酯化反应形成相应的酯类(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯等)，同时酸类物质也出现明显的增加(8)。
在腐乳前发酵阶段葡萄球菌属和明串珠菌属为主要优势菌群。随着发酵的进行，芽孢杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、链球菌属占主导地位，其中乳杆菌属和假单胞菌属都与脂肪酸类、酯类物质具有很强的相关性。这些菌在代谢过程中产生乙酸、丙酸、乳酸等，这些小分子有机酸可作为长链脂肪酸和酯的合成前体物质(8)。乳杆菌属生长使环境pH值迅速下降，从而能够抑制霉菌和腐败性菌的生长(8)；有些乳酸菌可产生有抑菌杀菌功能的细菌素，在发酵过程中具有双重的防腐作用。乳杆菌和酵母菌产生的乙醇、乳酸、乙酸等发酵产物可酯化形成乳酸乙酯和乙酸乙酯等呈香物质。部分乳杆菌属和明串珠菌属生成双乙酰、乙酰甲基原醇和3-羟基丁酮等芳香成分。有的乳酸菌可将蛋白质分解成肽和氨基酸，赋予食品独特的风味。假单孢菌属和芽孢杆菌属属于好氧菌，能分解蛋白和脂肪，产生一些风味前体物质；发酵过程中含氧量降低、酸度增加、发酵后期酒精度升高等因素可抑制芽孢杆菌的生长，使其丰度逐渐降低(8)。
3.5 新型腐乳微生物技术
随着生物技术的进步和消费需求的升级，腐乳产业正在经历新一轮的技术革新和产品创新。特别是在微生物应用技术方面，新的研究成果不断转化为产业实践，推动着传统腐乳产业的现代化发展。腐乳相关的新技术主要包括：腐乳发酵菌剂的开发改良和混配；低盐化健康腐乳的开发；添加其它成分如中草药的新型保健型和功能性腐乳的开发；含腐乳的其它食品类型的开发等。谷歌专利数据库搜索得到3845项腐乳相关的专利，现摘录最相关的160个专利中的部分成果，尤其是和微生物和腐乳发酵相关的成果。
腐乳发酵微生物菌剂
王知荣等开发了一种采用混合菌种总状毛霉和植物乳杆菌发酵制备的风味腐乳的制备方法，采用大豆为原料制成的豆腐白坯，喷洒总状毛霉孢子悬浮液至豆腐白坯表面进行前发酵，前发酵的培养温度为18-25℃；搓毛腌制，喷洒植物乳杆菌发酵液至豆腐坯上，装瓶、灌汤后进行密封后发酵至产品成熟(19)。
秦礼康等开发的腐乳促熟发酵复合菌剂由发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)复配而成。该复配菌剂可有效地提升腐乳的发酵速度，极大的缩短腐乳生产所需的后酵时间，并提升腐乳的风味及氨基酸态氮含量，使最终生产得到的腐乳风味更佳，并极大的缩短生产所需时间，提升经济效益(20)。
刘伟将耐冷荣氏毛霉(Mucor rongensis)用于低温生产腐乳，有利于抑制杂菌生长；该毛霉菌种产碱性蛋白酶，可以解决常见毛霉菌产酸性蛋白酶导致腐乳出现白点等问题；荣氏毛霉发达菌丝体将豆腐坯体紧紧包裹，有助于盐渍期维持腐乳的外观形状。后发酵过程接种嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)可提明显升产品风味。成品青腐腐乳具有外观完整、色泽纯正，臭味淡雅，口感细腻、鲜美等特征(21)。另外，刘伟还将荣氏毛霉(Mucor rongensis)，和巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)作为发酵菌剂用于红曲腐乳的制作(22)。
王成涛等根据微生物产酶特性进行发酵体系设计构建，添加驯化雅致放射毛霉、驯化米曲霉、红曲霉进行多功能菌协同发酵，获得所需的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯化酶、单胺氧化酶等丰富酶系；添加的红曲霉CGMCCNo.12502可产生高活性酯化酶、单胺氧化酶、Monacolin K，且具有降解生物胺活性；提供驯化米曲霉可产生高活性蛋白酶及肽酶；鲁氏接合酵母可分泌高活力糖化酶和单胺氧化酶。粪肠球菌CGMCC No.16677为益生菌，可产生高活性的细菌素GR17等天然抑菌物质，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、单核增生李斯特氏菌、芽孢杆菌等食物腐败菌和致病菌的生长，且具有分解生物胺活性，消除腐乳白坯和产品的潜在安全风险。卤汁中添加刺槐花(或杭白菊、桂花、玫瑰花、茉莉花、梨花、栀子花等)浸膏，增加花香，开发出多种花香风味低盐腐乳，丰富腐乳品类(23)。
覃焕达利用混合菌种进行腐乳发酵。取毛霉、米曲霉和黑曲霉按孢子数比为5-7:2-3:1-2混合得到混合菌种，然后用蒸馏水稀释至浓度为1-100×105孢子数/ml，按重量比1-3%的接种量接种到豆腐乳坯中，进行前期培菌。前期培菌发酵中主要是以毛霉酶系为主，米曲霉酶系和黑曲霉酶系为辅，因此在前期培菌中要保证毛霉生长占优势，其比例要大于50%，而米曲霉和黑曲霉生长时通常产生大量的孢子，所以要控制它们使用比例，避免使它们成为优势菌群，影响毛霉生长。而总孢子数浓度和接种量也是影响毛霉、米曲霉和黑曲霉生长的因素，过高的总孢子数浓度和接种量会造成毛霉、米曲霉和黑曲霉生长不良，而过低则会造成生长不足，将总孢子数浓度和接种量控制在上述范围内可以保证毛霉、米曲霉和黑曲霉发酵的正常进行(24)。
冯镇和石景春开发了一种由六个细菌菌株的腐乳专用发酵剂，包含藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、克氏库克菌（Kocuria kristinae）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和嗜盐四联球菌（Tetragenococcushalophilus）六株细菌，其配比为藤黄微球菌︰克氏库克菌︰肉葡萄球菌︰肠膜明串珠菌︰枯草芽孢杆菌︰嗜盐四联球菌=3︰2︰1︰1︰2︰1(25)。
刘贝宁等采用多菌株混菌发酵制备膏状腐乳，其最优工艺条件为：少孢根霉（Rhizopus oligosporus）：毛霉（Mucor）∶酵母∶植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）接菌比例为4∶2∶2∶2，接菌浓度1.0×106 CFU/mL，发酵温度32 ℃，发酵时间60 h，在此条件下，混菌发酵膏状腐乳的蛋白酶活力为123.84 μg/g，显著高于少孢根霉（90.07 μg/g）和毛霉（102.14 μg/g）单菌发酵腐乳（P＜0.05）。混菌发酵膏状腐乳前发酵结束时游离氨基酸总量为5.77 mg/g，其中34.35%是必需氨基酸，含量为1.98 mg/g，高于单菌株少孢根霉（4.25 mg/g）和毛霉（3.66 mg/g）发酵腐乳的游离氨基酸总量。混菌发酵膏状腐乳的综合评分最高，香气浓郁，且滋味丰富(26)。
低盐腐乳制品开发
食盐提供咸味，与腐乳中的谷氨酸结合，使腐乳产生鲜味。添加食盐降低水分含量，增加盐坯硬度。盐可抑制和防止杂菌污染，降低发酵过程中酶活性，使腐乳中的物质避免被过度分解。腐乳中盐含量过低会导致腐乳质地松散或腐败变质，引发食品安全问题；而盐含量过高则会使产品生产周期变长，增加消费者患病风险，使产品的消费受限制(2)。食盐含量低的样品蛋白质水解较快，游离氨基态氮的增长较快，总酸以及游离氨基态氮的含量随着腐乳的后期发酵而呈增加趋势(27)。马勇等研究了食盐对王致和腐乳生产过程中对蛋白质和脂肪水解的影响。王致和腐乳生产的盐坯含盐量16 %左右，成品腐乳的含盐量为11 %。在制备盐坯时，可以通过多加汤(汤中无食盐)的方法降低食盐含量，分别制备出5 %、8 %的低盐样品。食盐含量8 %的腐乳与食盐含量11 %的腐乳在保质期内不会败坏，而5 %食盐含量的腐乳在后期发酵阶段会酸败。该研究结果推荐在实际生产中可以进行8 %或稍低食盐含量腐乳的试生产(27)。
徐海蒂比较了利用雅致放射毛霉、少根根霉和纳豆菌为发酵菌种制备低盐腐乳，结果显示，雅致放射毛霉发酵的腐乳样品有较好的感官品质，比其它试验菌种更适宜用于低盐发酵；低盐白腐乳中乳酸菌数与其感官品质有显著相关性(28)。
杨智慧等对低盐腐乳的研究表明，随着盐含量的降低，腐乳中总酸、氨基酸态氮、水溶性蛋白、游离氨基酸含量逐渐升高、蛋白质水解程度逐渐增大。腐乳凝胶孔径逐渐缩小，结构更加致密均一。低盐腐乳中共检测出了45种挥发性风味物质，而且盐含量对挥发性风味物质含量、腐乳的滋味和质地影响较大，含盐6.8%的腐乳接受度最高(8)。
孟祥飞开发了一种低盐腐乳的制备方法，在后期发酵阶段将腐乳毛坯加入6%食盐、黄酒、10%食用酒精、凉白开水、酶制剂及辣酱，盖严毛坯，最后将瓶盖拧紧瓶口，放入32℃的恒温培养箱中进行4-6d腐乳的后期发酵。在腐乳后期发酵后的成品制备过程章放在室温20℃左右，再发酵30d左右待腐乳成熟，即制得低盐腐乳(29)。
无豆渣全豆腐乳
孙睿等开发了一种黑曲霉全豆腐乳，该研究选用黑曲霉（Aspergillus niger）发酵豆渣，对豆渣进行纤维细化，再以发酵后豆渣作为腐乳制作原料之一，在白坯制作过程中进行回填，通过发酵改善豆渣不适口的渣感，提高了豆渣的营养价值，使其更易被消化吸收。添加黑曲霉发酵豆渣的黑曲霉全豆腐乳呈黑褐色，有光泽；味道鲜美适口，咸味适中；具有腐乳特有香味，无不良气味；块型整齐，质地细腻，其水分、氨基酸态氮、水溶性蛋白质、总酸、食盐的含量分别为66.77%、0.44 g/100 mL、5.13 g/100 mL、0.55 g/100 g、10.07 g/100 g，达到相关国标要求。通过微观结构表征可知，其三维结构显示黑曲霉对豆渣粗纤维的分解效果十分优良，纤维组织在各种酶系的水解作用下已完全被破坏，并且无可见的纤维组织结构。通过此工艺制作出的腐乳，不仅提高了腐乳中的营养成分，而且提高了出品率。实现了高效利用资源，减少浪费，降低环境污染，为豆渣的综合利用提供理论依据(30)。
中草药保健腐乳
万勤劳等把中草药、香料、辅料等成分按比例制成卤料汤用于腐乳后期陈化过程，各成分配比如下：中草药、香料、和辅料的组份及重量份数配比为：柳枝45份、青风藤40份、苍术40份、透骨草45份、姜黄45份、川芎45份、地龙45份；以上中草药组合在一起构成一种治疗、预防风湿性关节炎疾病功效的中草药配方；香料组份及重量份数配比为：白菌40份、排草45份、香叶40份、草果40份、生姜40份、洋葱40份、胡椒55份、干红野山椒60份和花椒45份；辅料组份及重量份数配比为；番茄酱100份、胡萝卜酱100份、白酒40份、辣椒油50份、白糖100份。该产品在制作工艺中没有加入任何色素，各种添加剂及化学、矿物质等成份，纯属于自然发酵，产品呈红色或褐色，口感细腻，味鲜清香，具有治疗，预防疾病的健康绿色食品(31)。
顾永忠和李兴江开发了一种活血散瘀黑豆腐乳，由下列成分配方制成：黑豆1000‑1200、墨鱼汁50‑60、黑胡椒13‑15、食盐30‑35、大豆异黄酮2‑2.3、清酒130‑150、乳香13‑15、花生蛋白粉100‑120。这种黑豆腐乳盐卤量控制在6.5%左右，改善了品质，腐乳细腻，且更有弹性，味甜且无苦味，香气好，所含有益成分具有活血散瘀、抗氧化、降低胆固醇等保健作用(32)。
房婉萍等将茶粉用于后期腐乳发酵，豆腐坯：茶粉质量比为100:(0.5-10)。加入茶粉的腐乳具有提神消疲、生津清热的功效，保健作用强，便于市场推广(33)。
戴建忠用大豆、红豆、栀子、黄连、苁蓉、白芷、黄芪和大枣为原料制成豆腐乳坯，最后成品为可治疗疾病的红腐乳，其原料配比为：75-85份大豆、20-25份红豆、10-15份栀子、10-15份黄连、10-15份苁蓉、10-15份白芷、10-15份黄芪和10-15份大枣。该腐乳内外呈红色，口感好，增加了膳食纤维、维生素B群、维生素E、胡萝卜素等营养成分，具有营养保健的功效(34)。
邹聪终和何君英开发了一种中草药保健腐乳，豆腐坯含有的中草药原料为：以150公斤豆腐白坯为标准计量，取花椒100克、甘草150克、八角120克、肉桂120克、苟杞子100克、孜然150克、草果100克、白扣100克、金钱草100克、砂仁150克、五味子100克、陈皮100克、厚朴150克、山茱萸150克、紫丹参150克和良姜100克混合磨成细粉，备用；后期腌制发酵料含有：100斤豆腐白坯控制在7至8斤食用碘盐，碘盐、辣椒粉、中草药细粉配方比例是3：2：1，其中辣椒粉可根据南北口味适当调整(35)。
徐鑫等开发了一种丹皮石斛营养腐乳，选取新鲜的丹皮、石斛、杜鹃花，清洗后分别切碎成丹皮粒、石斛粒、杜鹃花粒，取5kg的丹皮粒、3.5kg的石斛粒、1.5kg的杜鹃花粒，混合均匀后制得混合原料，将10kg混合原料放在20kg的水中煎煮，温度控制为90℃，煎煮25min，重复煎煮3次，将煎煮液混合。将色泽光亮、颗粒饱满的黄豆去除杂质，清水清洗干净后将黄豆放入其重量2-3倍的原料汁中，并加入黄豆重量50-60%的枇杷汁、20-30%的麦芽汁、4-6%的食盐，搅拌均匀，在20-25℃的条件下浸泡10-12h后进行打浆，制成豆浆，最后制坯发酵制成营养腐乳(36)。
回顾与展望
本文系统综述了腐乳发酵的微生物学基础及其应用技术发展。作为我国传统发酵食品的代表，腐乳凝聚了千百年来民间智慧与现代科学的完美结合。从早期经验传承到现代分子生物学技术的应用，腐乳微生物学研究经历了从定性到定量、从经验到理性的转变过程。
毛霉属、酵母菌属和乳酸菌属等优势菌群通过蛋白水解、脂肪降解和次级代谢等生化途径，赋予腐乳独特的软糯质地与咸鲜香气。高通量测序技术揭示了不同地域、不同工艺腐乳中微生物群落的多样性与演替规律，为传统工艺的科学解析提供了新视角。气相色谱-质谱联用等现代分析技术则精确鉴定了腐乳中数百种风味物质，阐明了微生物代谢与风味形成的内在联系。
基于对腐乳微生物系统的深入理解，低盐腐乳、功能性腐乳等创新产品应运而生，既满足了现代消费者健康需求，又为传统食品的产业化发展注入新活力。然而，腐乳微生物组学、代谢组学和功能基因组学等前沿研究仍处于起步阶段，关于微生物间协同作用机制、风味代谢调控网络等核心科学问题有待进一步探索。
展望未来，腐乳微生物学研究将更加注重基础理论与应用创新的结合，通过功能菌种定向筛选与改良、发酵工艺精准调控、生物安全性评价等技术突破，推动腐乳产业向标准化、多元化、国际化方向发展，使这一古老的东方智慧在全球健康食品版图中焕发新的生机。
结语：千年腐乳，微生物的舞台与人类的智慧
从古代先民偶然发现霉变豆腐可食，到当代科学家解码微生物基因组，腐乳这一东方发酵艺术见证了人类与微生物共舞的精彩历程。腐乳，这块看似普通的"东方奶酪"，其实是亿万微生物的生命舞台，也是中华民族食品智慧的结晶。
闭上眼睛，想象一下：当我们咬下一块腐乳时，那入口即化的软糯质地，是毛霉菌丝辛勤编织的网络；那浓郁醇厚的鲜味，是乳酸菌和酵母默默奉献的礼物；那独特的馥郁香气，是数百种芳香分子谱写的交响乐。腐乳之所以成为"东方神奇"，正是因为它不是简单的食物，而是微观生命的艺术品。
在古老的作坊里，师傅们通过观察毛坯上霉菌生长的颜色、闻坯体的气味来判断发酵进程；而在现代实验室中，科学家们则通过高通量测序解析微生物群落结构，通过气相色谱-质谱联用技术捕捉每一种风味分子。科学并未消解传统的魅力，反而为其增添了新的维度。我们惊叹于先人在没有显微镜的年代，如何凭借经验驯服了这些看不见的生命，创造出如此精妙的发酵工艺。
当"慢食"理念与健康意识在全球兴起，腐乳这一耗时数月精心酿造的美食，正迎来新的发展契机。从云南高山村落的青腐乳，到北方平原的克东腐乳，每一种地方特色腐乳都承载着独特的微生物生态和文化记忆。如今，科学家们正借助现代生物技术，开发低盐腐乳、功能性腐乳等新产品，让这一古老食品焕发新的生机。
腐乳故事未完待续。微生物学家正探索菌群间的交流机制，食品科学家正解析风味形成的分子密码，传统工艺正与现代科技碰撞融合。千年腐乳，既是历史的见证，也是未来的希望。它提醒我们：在这个快节奏的时代，有些美味值得等待；在这个追求标准化的世界，有些多样性值得珍惜；在人与自然的关系中，有些微小生命值得尊重。
腐乳，不仅是餐桌上的美食，更是中华饮食文化中微生物与人类智慧完美融合的象征。让我们怀着敬意品味每一块腐乳，感受那穿越千年的微妙滋味。
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