1. 厌氧微生物滚管分离技术

亨盖特厌氧滚管技术（Hungate Anaerobic Roll-Tube Technique) 是美国微生物生态学家亨盖特于20世纪50年代发明的用于厌氧微生物分离纯化的技术方法，并由后来研究者不断改进完善。厌氧滚管技术可用于各类严格厌氧型微生物的分离纯化，包括硝酸盐还原菌、发酵性细菌、硫酸盐还原菌等。本实验室将滚管技术用于纤维素发酵产生物燃料的梭状芽孢杆菌、用于重金属六价铬还原性生物修复的硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌等。每个厌氧实验室的厌氧操作方法各不相同，这里只是为了介绍厌氧菌分离纯化的操作方法和强调厌氧操作的原理。应该特别强调的是，本操作流程最大的优点是省却了滚管机，所以一般实验室无须特地购置滚管机也可以做滚管分离实验。

厌氧操作应注意最基本两个点：无菌和无氧。

无菌：和普通有氧微生物实验一样，厌氧微生物实验必须坚持无菌操作。在通氮气保护滚管厌氧环境时，应该利用酒精灯火焰使管口周围保持无菌状态。利用注射器针头转接培养物前，用酒精拭片或棉球擦拭滚管橡胶盖子表面。打开的盖子如果不小心接触其它表面，也用酒精拭片擦拭后再重新盖入试管。在厌氧手套箱中转接培养物，因其内部无氧而无法用火焰，这种情况下其实是非严格的无菌操作，请务必尽量缩短培养物在厌氧箱气相空间中的暴露时间，减少受污染概率。
无氧：在开发空间实验台上进行厌氧操作时，厌氧状态是由连续通氮气来实现的。由于和外界空气是相通的，气流扰动会使少量氧气接触到厌氧培养物，所以厌氧操作需缩短操作时间，尽量减少氧气对厌氧微生物的抑制。有时我们在没有氮气保护的情况下打开一个含菌落的厌氧滚管，如果只须从一个试管里挑一个菌落迅速转接到液培，这种情况下虽然不是严格厌氧，但是由于我们不再使用原来的厌氧管，不在这个试管中实行氮气保护仍然可接受；但是要从同一滚管中挑多个菌落时，应该另接一个通气口使用氮气保护。具体情况根据该培养物的耐氧特性酌情处理。

2. 利用亨盖特厌氧滚管技术分离严格厌氧微生物

涉及滚管实验的厌氧管应该是无菌无氧的，注射器和针头灭菌后烘干的。
通过橡胶管的氮气过滤除菌后通过厌氧试管，由另一个注射器作出气口，这个出气口用于接种注射器氮气置换除氧。
将火焰置于氮气出口的附近，以确保接种过程中的无菌操作。
将接种注射器的针头伸入到作为氮气出口的注射器中抽吸换气3-5次。
将装有原始样品或富集培养物的厌氧试管管口用酒精擦拭后晾干或蘸取少量酒精后用火焰灼烧灭菌。
用置换过氮气的注射器吸取0.05-0.5mL样品，注入到第一个含有预置与50-55C水浴中的液化后的琼脂培养基，漩涡混匀后，用一个新的注射器吸取0.5mL转接至另一个含5mL培养基的试管中进行10倍系列稀释。
系列稀释完成后，将接种后的琼脂培养基轻轻上下倒置混匀，在冰水混合物中滚管至琼脂凝固。

涉及滚管实验的厌氧管应该是无菌无氧的，注射器和针头应该是灭菌后烘干的。

通过橡胶管的氮气是过滤除菌后通过厌氧试管的，由另一个注射器作出口，这个出口是用于接种注射器氮气置换除氧的。

将火焰置于氮气出口的附近，以确保接种过程中的无菌操作。

将接种注射器的针头伸入到作为氮气出口的注射器中抽吸换气3-5次。

将装有原始样品或富集培养物的厌氧试管的管口用酒精擦拭后晾干或蘸取少量酒精后用火焰灼烧灭菌。

用置换过氮气的注射器吸取0.05-0.5mL样品，注入到第一个含有预置与50-55C水浴的液化后的琼脂培养基，混匀后，用一个新的注射器吸取0.5mL转接至另一个含5mL培养基的试管中进行10倍系列稀释。

预置与50-55C水浴的液化后的琼脂培养基。

用置换过氮气的注射器吸取0.05-0.5mL样品，注入到第一个含有预置与50-55C水浴的液化后的琼脂培养基，混匀后，用一个新的注射器吸取0.5mL转接至另一个含5mL培养基的试管中进行10倍系列稀释。

系列稀释完成后，将接种后的琼脂培养基轻轻上下倒置混匀后在冰水混合物中滚管至琼脂凝固。

3. 厌氧滚管琼脂层中生长的单个菌落的显微形态

厌氧滚管技术的最大的优势之一是：可用肉眼和低倍显微镜（4X 或10X）观察菌落的形态和纯度，以确定单个菌落周围是否混杂有其他菌落。而其他厌氧方法如倒置琼脂培养法或液培终极稀释法等均无法确认所挑取或转接的是单个菌落，所以请阅读文献时多加以区别，实验方法不同可能导致结果和结论的差异。

4. 厌氧滚管单菌落从固培到液培的挑取转接

先设置一个无菌厌氧试管，氮气过滤后经一长针头通入试管底部，确保试管内部的厌氧环境。这个试管用于玻璃吸管的氮气置换。
将一个装有液体培养基的厌氧试管打开，氮气过滤后经一长针头通入试管底部，确保试管内部的厌氧环境。这个试管装有新鲜的液体培养基可供细菌生长。
全程应为严格的无氧无菌操作。分别将火焰置于两个试管旁边。
厌氧菌落吸管由普通长尖头巴斯德吸管改制而成：将长尖头巴斯德吸管的尖端0.5-1厘米处置于火焰上方，轻度灼烧后玻璃软化，尖端自然随重力下垂，检查尖端和玻璃管内通道，如果尖端未变形，通道未堵塞，吸管便可用于厌氧菌落吸取转接。
吸管的另一端由小段棉花堵塞，以防止外界的杂菌进入吸管，然后吸管可灭菌干燥后备用。
吸管的棉花一段套上普通的橡胶头就可用于换气和菌落吸取了。
将含有单个菌落的厌氧试管的橡胶塞打开，将换气后的吸管伸入至菌落上方，捏紧橡胶头，将吸管的弯尖头插入菌落位置，放松橡胶头，含有菌落或部分菌落的小块琼脂便被吸入到吸管尖头部分。
将含有菌落的吸管转移至装有新鲜培养基的另一个厌氧管，将尖头插入到培养基液面以下，反复抽吸液体培养基，以确保琼脂块进入到液体培养基中。
挑取菌落完成后，将橡胶塞用酒精消毒，然后迅速盖紧厌氧试管。
仔细观察液体培养基，检查含有菌落的琼脂块是否悬浮在液培中。