石油污染的微生物修复

造成环境污染的石油烃主要来源于自然界石油蕴藏的天然渗出和石油生产、转运和储存过程中的泄漏。大规模的原油泄漏对海洋和陆生生物具有长期危害。在自然状态下，许多不同种的微生物都具有降解和转化原油组分的能力。生物修复是利用自然界中的微生物活性以减少和降低各种化学物质和浓度和毒性的过程。微生物的石油降解能力是石油污染生物修复的生物学基础，直接决定生物修复的效率。

石油降解细菌的表型特性和系统发育分析

我们从三种不同土壤中分离和纯化得到10个石油降解细菌菌株。分离菌株均为好氧菌、革兰氏阴性菌、不形成芽孢的杆菌。10个菌株均能利用中等链长的烷烃，柴油和原油作为碳源，而不能以单环芳烃和多环芳烃为碳源。根据其生理生化性状和16S rDNA序列分析结果表明，这10个菌株分别属于假单胞菌(Pseudomonas spp. )和不动杆菌 (Acinetobacter spp.), 均属于Proteobacteria 的γ 亚群。

分离得到的Acinetobacter属菌株在生理生化水平和16S rDNA序列上均显示差异，而Pseudomonas属分离菌株的16S rDNA序列差异较小。其中两个菌株的16S rDNA序列相似性达100％，但菌落形态表现出差异，前者菌落中央区强烈皱缩，后者平坦。由于16S rDNA序列高度保守，所以有时仅仅从16S rDNA序列水平分析则无法解析亲缘关系较接近的菌株之间的差异。因此，利用其它分子手段阐明菌株之间的差异是非常必要的。

Acinetobacter属的分离菌株在基质利用上表现出多样性。其中一个菌株不能利用萘、菲和芴等多环芳烃，但能利用苯甲酸钠和水杨酸，二者均为芳烃降解的中间代谢产物，由此可推测该菌株可能参与自然条件下芳烃降解过程和原油等烷烃芳烃混合物中依赖于烷烃的芳烃共代谢降解过程。研究该菌株与芳烃降解菌株的混培物对烷烃和芳烃混合物的降解对于阐明某一生境中有机物降解代谢多样性具有非常重要的意义。

常见的石油降解微生物属包括Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Aspergillus  , Bacillus, Candida, Corynebacterium, Flavobacterium, Fusarium, Micrococcus , Mycobacterium, Mucor, Nocardia, Penicillum，Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodoterula, Sporobolomyces等。但是本研究用7种不同培养基，从三种不同土壤(桑园土壤，油田土壤和油污土壤)，以原油和柴油为碳源富集，分离和纯化得到的10个石油降解菌株仅分别属于Acinetobacter 和Pseudomonas。这两个属亲缘关系较为接近，均为γ-Proteobacteria。尽管石油中含有烷烃、芳香烃、树脂、沥青，但是利用石油培养基分离的菌株仅为烷烃降解菌，这可能是由于烷烃为石油的主要组分，而芳香烃、树脂、沥青等均为少量基质，因此分离过程中优先富集得到烷烃降解菌。原先希望得到的芳烃降解菌尚未分离得到。因此分离菌株可能只是最适于实验室的种，并非自然条件下主要的降解微生物，无法代表整个石油降解微生物区系。不可培养微生物的研究和从分子水平重建石油降解微生物区系是未来重要的研究方向。

石油降解菌Pseudomonas sp. 菌株和Acinetobacter sp. 菌株利用石油生长过程中和油滴形成米粒大小的团粒。

石油降解细菌基于16S-23S间隔序列的比较分析

我们利用PCR扩增和测序获得10个石油降解菌株ITS序列。基于16S rDNA和ITS的序列比对和系统发育分析表明，5个Pseudomonas属分离物的16S rDNA和ITS高度保守，ITS的变异略大于16S rDNA。根据表型特性，16S rDNA和ITS结果可将5个假单胞菌菌株确定为Pseudomonas aeruginosa。

5个Acinetobacter属分离菌株的表型特性，16S rDNA和ITS的分析结果存在一些矛盾，确定种水平分类的地位仍需进一步研究。现有的Acinetobacter属的分类体系仍较混乱，使Acinetobacter属分离菌株的分类地位无法确定。Bouvet和Grimont根据DNA-DNA杂交将该属分为12个DNA群，其中只有genospecies 1,2,4,5,7,8命名为Acinetobacter calcaoaceticus, A. baumannii, A. haemolyticus, A. junii, A. johnsonii, A. lwoffii。后续研究又加入DNA群13和15，以及另外5个蛋白水解群。在生理生化特性上，DNA群1，2，3，13在表型特性上不表现差异，因此上述4群统称为Acinetobacter calcaoaceticus-baumannii复合群。16S rDNA序列的比对分析无法反映分类地位接近的细菌的进化关系，而且与DNA-DNA杂交结果有矛盾。因此为解决现有体系中的混乱和矛盾，同时利用多种分子方法对大量Acinetobacter属菌株进行研究是非常有意义的。

参考文献

韩如旸，闵航，程志强，柳良好。石油降解细菌的表型特性和系统发育分析。生物多样性，2002，10（2）：202-207.

Ruyang Han, Hang Min, Zhiqiang Cheng, Lianghao Liu. 2002. Phenotypic characteristics and phylogenetic analysis of crude oil degrading bacteria. Biodiversity Science, 10(2):202-207.